Podawanie aktywowanego węgla z kory zawierającej płyn z octem drzewnym (Nekka-Rich) jest skuteczne w terapii kryptosporydiozy u cieląt.

1 Laboratorium Immunologii Weterynaryjnej, Departament Nauk Weterynaryjnych, Studium Podyplomowe Nauk o Życiu i Środowisku, Uniwersytet Prefektury Osaka, 1-1 Gakuen-cho, Naka-ku, Sakai, Osaka 599-8531 Japonia
2 Instytut Badań, Miyazaki-Midori Pharmaceuticals Inc., 945 Hieda, Akae, Miyazaki 880-0912 Japonia
3 Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytecki Szpital Weterynaryjny, Szkoła Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Rakuko Gakuen, 582 Bunkyodai-Midorimachi, Ebetsu, Hokkaido 069-8501 Japonia

Streszczenie
Wpływ zastosowania węgla aktywowanego zawierającego ocet drzewny (Nekka-Rich) na Cryptosporidium parvum  oceniono w badaniach  in vitro i in vivo. Najpierw wykonano analizę pochłaniania C.parvum przez węgiel aktywowany będący składnikiem preparatu Nekka-Rich. Po wymieszaniu, oocysty C.parvum zostały skutecznie zaadsorbowane przez węgiel aktywowany. Następnie oceniono działanie octu drzewnego pochodzącego z Nekka-Rich. Ocet drzewny wykazuje działanie przeciwpierwotniakowe wobec oocyst C.parvum. W ostatnim etapie oceniona działanie Nekka-Rich przeciw kryptosporydiozie u cieląt eksperymentalnie zainfekowanychC.parvum. Sześć nowonarodzonych cieląt w wieku 6 dni zostało doustnie zainfekowanych  oocystami C.parvumw dawce 1×105. Gdy w trzecim dniu od zakażenia doświadczalnego wystąpiła biegunka, trzem cielętom podawano preparat mlekozastępczy zawierający 10g Nekka-Rich w ośmiogodzinnych odstępach przez 4 kolejne dni, a trzem cielętom z grupy kontrolnej podano preparat mlekozastępczy bez Nikka-Rich w odstępach ośmiogodzinnych przez 4 kolejne dni. Cielęta karmione mlekiem z Nekka-Rich wykazały poprawę 1 dzień po rozpoczęciu terapii. U cieląt karmionych Nikka-Rich zaobserwowano znacząco mniejsza wydalanie oocystC.parvum z kałem. W drugim dniu po rozpoczęciu terapii (dzień piąty po zakażeniu kontrolnym) nie wyizolowano oocyst z próbek kału. Jednocześnie, u cieląt z grupy kontrolnej nie poddanym terapii wystąpiła ostra biegunka, a w kale obserwowano stałe wydalanie oocyst. Cielęta obu grup zostały poddane eutanazji w celu pobrania próbek, które następnie poddano analizie w skaningowym mikroskopie elektronowym. To badanie wykazało przyleganie oocyst C.parvum do powierzchni nabłonka jelitowego u cieląt z grupy kontrolnej nie poddanych terapii, podczas gdy u cieląt karmionych Nikka-Rich takiego przylegania nie zaobserwowano. Wyniki te sugerują, że Nikka-Rich mógłby być przydatny w terapii kryptosporydiozy u nowonarodzonych cieląt.
Słowa kluczowe: węgiel aktywowany, kryptosporydioza, biegunka, ocet drzewny

WSTĘP
Criptosporidium parvum jest jelitowym pierwotniakiem pasożytniczym, wywołującym biegunkę zarówno u ludzi jak i zwierząt domowych (Casemore i in.,1997; Anderson, 1998; Xiao i in., 2004). W przypadku zwierząt gospodarskich, zakażenie C.parvum u cieląt stanowi dla producentów problem zarówno kliniczny jak i ekonomiczny (Casemore i in., 1997). Ponieważ kał cieląt stanowią poważne źródło Cryptosporidium, zakażenie wody pitnej kałem jest potencjalnym środkiem rozprzestzreniania się  tego pierwotniaka (Smith, 1998; Fayer i in., 2000). Dlatego zwalczanie zakażeń C.parvum u cieląt jest konieczne nie tylko do ograniczenia ich skutków klinicznych i ekonomicznych dla producentów, ale także w celu zmniejszenia zagrożenia związanego z zakażeniem środowiska i ochroną zdrowia publicznego.
Węgiel aktywowany jest znany jako uniwersalny adsorbent (środek pochłaniający), ponieważ może on łączyć się z różnymi cząsteczkami (Chandy i Sharma, 1998). Stwierdzono, że węgiel aktywowany skutecznie eliminuje bakterie i toksyn bakteryjne zarówno in vitro jak i in vivo (Drucker i in., 1977; Peques i in., 1979, Du i in., 1987; Gardiner i in., 1993). W ostatnim czasie wykazaliśmy przydatność węgla aktywowanego w usuwaniu wytwarzających werotoksyny Escherichia coli oraz samych werotoksyn (Naka i in., 2001). Inni badacze zaobserwowali, że kwasy organiczne hamują wzrost bakterii enteropatogennych (Anderson, 1992; Hsiao i Siebert, 1999; Nakai i Siebert, 2003), jak również zdolność do przetrwania C.parvum (Kniel i in., 2003). Nekka-Rich (Miyazaki-Midori Pharmaceuticals Inc., Miyazaki, Japonia) jest produktem wytworzonym poprzez zmieszanie węgla aktywowanego i octu drzewnego, zawierającego kwasy organiczne. Węgiel aktywowany i ocet drzewny Nekka-Rich są pozyskiwane z kory dębu wiecznie zielonego (Castanopsis cuspidata oraz Quercus acuta) poprzez karbonizację.
Na podstawie przeprowadzonego niedawno w naszym laboratorium badania, które wykazało, że Nikka-Rich skutecznie hamuje zakażenie Salmonella enterica o serotypie enteritidis u kurcząt (Watarai i Tana, 2005), wysnuliśmy hipotezę, że Nikka-Rich może być przydatna w zapobieganiu zakażeniu C.parvum u cieląt, poprzez zahamowanie adsorpcji oocyst do nabłonka jelita i redukcję ich zdolności do przeżycia. W związku z tym przebadaliśmy każdy składnik Nekka-Rich pod kątem działania in vivo wobec C.parvum oraz oceniliśmy całość produktu pod kątem działania u nowonarodzonych cieląt zakażonych kontrolnie C.parvum. Dodatkowo poddaliśmy również ocenie zdolność Nikka-Rich do zahamowania kolonizacji jelitowej C.parvum u nowonarodzonych cieląt zakażonych kontrolnie C.parvum.

MATERIAŁY I METODY
Materiały i pasożyty
Węgiel aktywowany i ocet drzewny, które są pozyskiwane z kory dębu wiecznie zielonego (V.cuspidata i Q.acuta) a także Nekka-Rich (produkt wykonany z tych dwóch składników) otrzymano od Miyazaki-Midori Pharmaceuticals Inc. W Japonii Nekka-Rich jest dozwolonym dodatkiem paszowym. Oocysty Cryptosporydium parvum pobrano metodą flotacyjną z użyciem sacharozy z kału cieląt zarażonych kryptosporydiozą, zgodnie z wcześniejszym opisem (Uga i in. 2000). Oczyszczone oocysty wykorzystano do eksperymentów in vitro i in vivo.

Test adsorpcji in vitro
Niniejsze badanie ma na celu zbadanie skuteczności węgla aktywowanego z kory dębu wiecznie zielonego pod kątem adsorpcji C.parvum. Oocysty  Cryptosporidium parvum (2 x 10 4 oocyst) w 1 ml PBS (pH 7.2) i węgiel aktywowany z kory dębu wiecznie zielonego (0,1,5 i 10 mg) zmieszano razem i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z łagodnym wytrząsaniem. W celu usunięcia węgla aktywowanego, mieszaniny przepuszczono przez filtr membranowy (Millipore, Bedford, MA; rozmiar otworu 10 μm), wypłukany 10 ml PBS. Filtraty odwirowano przez 10 minut w 1200 x g, a otrzymany supernatant został zdekantowany. Pozostałą grudkę oocyst zawieszono w PBS (100μL) a liczbę oocyst oceniono 3 razy w hemocytometrze.

Działanie in vitro octu drzewnego na oocysty C.parvum
Oocysty Cryptosporydium parvum (6 x 104 oocyst) umieszczono w 1 ml PBS zawierającym 0, 0,5 i 5,0% ocet drzewny, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 14 godzin z łagodnym wytrząsaniem. Po okresie inkubacji każda mieszanina z oocystami została odwirowana w 1200 x g przez 10 minut, a powstały sypernatant usunięto, zgodnie z powyższym opisem. Oocysty ponownie zawieszono w 100 μL PBS i oliczono 3 razy w hemacytometrze.

Zwierzęta
Sześć nie zakażonych naturalnie C.parvum cieląt rasy holsztyńsko-fryzyjskiej płci męskiej w wieku 3 dni życia zakupiono od lokalnych farmerów. Cielęta przetrzymywano osobno w pomieszczeniu izolatkowym 2. stopnia bioasekuracji dla zwierząt gospodarskich Weterynaryjnego Szpitala Uniwersyteckiego, Szkoła Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Rakuno Gakuen (Ebetsu, Japonia). Cielęta karmiono komercyjnie dostępnym preparatem mlekozastępczym (Scientific Feed Laboratory Co. Ltd., Tokio, Japonia) w przerwach 8 godzinnych przez cały okres trwania eksperymentu. Opieka nad zwierzętami pod kątem badania przebiegała zgodnie z wytycznymi Komisji Uniwersytetu Rakuno Gakuen dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystaniem.

Eksperymentalne zainfekowanie cieląt C.parvum i podanie Nekka-Rich 
Sześć cieląt przydzielono losowo do 2 grup eksperymentalnych (3 cielęta w grupie). Kontakt fizyczny miedzy cielętami został uniemożliwiony. Wszystkim cielętom podano doustnie 1 x 105 oocyst C.parvum. Po wystąieniu biegunki cielętom z nieleczonej grupy kontrolnej podano komercyjny preparat mlekozastępczy bez Nikka-Rich, natomiast cielęta w grupie leczonej Nekka-Rich otrzymały preparat mlekozastępczy zawierający 10g Nekka-Rich w każdym karmieniu przez 4 dni. Wszystkie odchody poddano badaniu mikroskopowemu pod kątem występowania zakażenia C.parvum. Odpowiedź kliniczna każdego cielęcia była odnotowana w trakcie całego eksperymentu pod kątem występowania i intensywności biegunki, a także wydalania oocyst w kale. Obecność biegunki oparto na zapisie konsystencji kału zgodnie z następującym indeksem: 1= normalne odchody; 2=miękkie odchody; 3= łagodna biegunka; 4= ostra biegunka wodnista. Od każdego cielęcia pobierano próbkę kału raz dziennie, począwszy od dnia 0 aż do dnia 7, a następnie próbki te badano pod kątem obecności oocystC.parvum za pomocą metody flotacyjnej z użyciem sacharozy. W skrócie, 5.0 g odchodów wymieszano z 30ml wody dystylowanej, następnie zawiesina z odchodami została przepuszczona przez nierdzewne sito, w celu usunięcia substancji stałych, a nastepnie odwirowana w 300 x g przez 10 minut. Każdy z uzyskanych supernatantów został zlany, a osad zawieszony ponownie w 14 ml roztworu sacharozy (ciężar właściwy: 1.2). Zawiesina została przeniesiona do probówki do odwirowań a nastepnie odwirowana przez 10 minut w 300 x g. Po odwirowaniu, probówkę pozostawiono na 10 minut. Jedną kroplę supernatantu umieszczano na szkiełku mikroskopowym, i po nałożeniu szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18×18 mm poddawano analizie w powiększeniu 1000x w mikroskopie świetlnym (Olympus Co., Tokio, Japonia). Próbki z odchodami zawierające oocysty podzielono na następujące cztery kategorie wynikowe: 0: zero oocyst we wszystkich polach widzenia; 1:<10  oocyst w 30 polach widzenia; 2: ≥10 do <300 oocyst w 30 polach widzenia; 3:≥300 oocyst w 30 polach widzenia. Siedem dni po zakażeniu kontrolnym C.parvum zwierzęta zostały poddane eutanazji, zgodnie z wytycznymi Komitetu do spraw opieki i wykorzystywania zwierząt Uniwersytetu Rakuno Gakuen, a fragmenty jelita cienkiego zostały pobrane celem oceny stopnia kolonizacji C.parvum.

Skaningowy mikroskop elektronowy
Skaningowy mikroskop elektronowy został wykorzystany do oceny kolonizacji jelit przez C.parvum. Próbki tkanek ze środkowych części dwunastnicy, jelita czczego i biodrowego utrwalono w 3.0% aldehydzie glutarowym w buforze fosforanowym 0.1M (pH 7.4) przez 2 godziny w temperaturze 4°C, a w czterotlenku osmu w 0.1 M buforze fosforanowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Pasma tkanki zostały odwodnione za pomocą stopniowanej serii acetonu, poddane działaniu alkoholu t-butylowego, osuszone w urządzeniu liofilizatorze (JFD-300, JEOL, Tokio, Japonia), pokryte warstwą złota o grubości 10 nm w maszynie do powlekania jonowego (NL-OPC40, JEOL Datum Ltd., Tokio, Japonia) i przebadane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (JSM600F, JEOL).

Analiza statystyczna
Do analizy wyników in vitro wykorzystano test t-Studenta. Wyniki zostały wyrażone jako średnia arytmetyczna ze standardowym błędem średniej (średnia ± SEM). Dodatkowo, zebrano dane dotyczące ilości cieląt z biegunką i ilości cieląt wydalających oocysty dla każdej grupy terapeutycznej, w każdym dniu pobrania danych. Zebrane dane zostały następnie porównane między leczonymi grupami przy użyciu testu dokładnego Fishera. Poziom istotności dla wszystkich testów statystycznych został określony na poziomie P≤0,05.

WYNIKI
Działanie adsorpcyjne węgla aktywowanego pozyskanego z kory dębu wiecznie zielonego na C.parvum
Jak pokazano na rycinie 1, węgiel aktywowany z kory dębu wiecznie zielonego spowodował zależną od dawki adsorpcję oocyst C.parvum. Uściślając, kiedy oocysty C.parvum (2 x 104 oocyst) inkubowano z 0,1,5 i 10 mg węgla aktywowanego w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, ilość oocyst wynosiła odpowiednio 1,89  ± 0,11 x 104, 1,2 ± 0,12 x 104 (P<0,0125), 7,87 ±0,59 x 103 (P<0,001) i 4,43 ±0,3 x 103 (P<0,0003).

Działanie octu drzewnego na oocysty

Jak pokazano na ilustracji 2, ilość oocyst C.parvum uległa obniżeniu zależnemu od dawki po podaniu octu drzewnego. Jednakże, ilość oocyst nie uległa zmianie, kiedy C.parvum były inkubowane z PBS bez dodatku octu drzewnego.

Rycina 1. Zdolność węgla aktywowanego do adsorpcji C.parvum. Dane wyrażone są jako średnia ±SE z trzech powtórzeń. *=P<0.0125, #=P<0.001, @=P<0.0003 w porównaniu z grupą kontrolną (0 mg) (test t-Studenta).

a
Węgiel aktywowany
Odpowiedź kliniczna cieląt po ekspozycji na oocysty C.parvum
Obserwacje kliniczne cieląt po ich narażeniu na oocysty C.parvum i terapię Nekka-Rich przedstawiono są w tabeli 1. Wszystkie cielęta z grupy nieleczonej, po narażeniu na oocysty C.parvum wykazały w dniach od 3 (po narażeniu) do 7 (ostatni dzień eksperymentu) łagodną (średnia konsystencja odchodów 3.3) do ostrej, wodnistej biegunki (średnia konsystencja odchodów 3.7).

Rycina 2. Działanie octu drzewnego na Cryptosporidium parvum. Dane wyrażone jako średnia ± SEM z trzech powtórzeń. *=P<0.0014, #=P<0.0006, @=P<0.0004 w porównaniu z grupą kontrolną (0%) (test t-Studenta).

b
Ocet drzewny

 

TERAPIA KRYPTOSPORYDIOZY U CIELĄT

Tabela 1. Odpowiedź kliniczna cieląt na zakażenie kontrolne oocystami Criptosporidium parvum i leczenie Nekka-Rich od dnia 0 do 7

Cielęta z biegunką2 / całkowita liczba cieląt, n/n
Grupa1 0 1 2 3 4 5 6 7
A 0/3
(1,0)
0/3
(1,0)
0/3
(1,0)
3/3
(3,3)
3/3
(3,3)
3/3
(3,3)
3/3
(3,3)
3/3
(3,3)
B 0/3
(1,0)
0/3
(1,0)
0/3
(1,0)
3/3
(3,3)
0/3*
(2,0)
0/3*
(2,0)
0/3*
(2,0)
0/3*
(2,0)

1 A= cielęta z grupy kontrolnej nieleczonej; B= cielęta leczone Nekka-Rich.
2 Dane w nawiasach to wyniki średniej konsystencji kału: 1= kał normalny; 2= kał miękki; 3=łagodna biegunka; 4= ostra wodnista biegunka.
*P= 0.05 w porównaniu z grupą A (test dokładny Fishera).

Wystąpiła różnica w wyniku konsystencji kału między nieleczoną grupą kontrolną i grupą leczoną Nekka-Rich. Pomimo tego, że w grupie leczonej cieląt wystąpiła łagodna biegunka w dniu 3 po zakażeniu kontrolnym (P=1.0), ich kał miał miękką konsystencję przez 1 dzień po podaniu preparatu mlekozastępczego zawierającego Nekka-Rich (d 4: P=0.05) i nie zaobserwowano żadnych innych zaburzeń biegunkowych w okresie podawania preparatu mlekozastępczego zawierającego Nekka-Rich (d 5, 6 i 7: P=0.05).

Obecność oocyst C.parvum w kale
Tabela 2 przedstawia hamujące działanie preparatu mlekozastępczego zawierającego Nekka-Rich na wydalanie oocyst C.parvum. W dniu 4 od podania oocyst C.parvum, zostały one wyizolowane z próbek odchodów wszystkich cieląt. Zauważono istotną różnicę w wyniku dotyczącym liczby oocyst między grupą cieląt nieleczonych i poddanych działaniu Nekka-Rich w dniu 5,6 i 7 po podaniu oocyst. Cielęta nieleczone wydalały oocysty aż do końca eksperymentu (d 7).  Dla porównania nie wyizolowano żadnych oocyst z próbek odchodów cieląt karmionych Nekka-Rich (P=0.05) w okresie od dnia 5 po aplikacji do 7.

Wykrycie przylegania C.parvum w jelicie cienkim cieląt
Rycina 3 przedstawia obraz ze skaningowego mikroskopu elektronowego powierzchni jelita biodrowego grupy kontrolnej i leczonej Nekka-Rich. W fragmentach jelita biodrowego cieląt nieleczonych widoczne było przyleganieC.parvum do ich powierzchni. Dla porównania nie wykazano przylegania C.parvum do ciany jelita biodrowego u cieląt leczonych Nekka-Rich. Inne części jelita cieląt leczonych Nekka-Rich, takie jak dwunastnica i jelito czcze również nie wykazały przylegania oocyst wzdłuż powierzchni nabłonkowej jelita, podczas gdy w przypadku cieląt z grupy nieleczonej zauważono oocysty przylegające do powierzchni nabłonkowej dwunastnicy i jelita czczego (dane nie uwzględnione). Wyniki te zgadzają się z wynikami dotyczącymi wyizolowania oocyst C.parvum, przedstawionymi w Tabeli 2.

DYSKUSJA    
Wykazaliśmy, że węgiel aktywowany Nekka-Rich wykazuje działanie adsorpcyjne wobec C.parvum. Uogólniając, węgiel aktywowany ma wysoką zdolność adsorpcyjną, jednakże jego działanie nie jest selektywne (Wicks i inni, 1980; Chandy i Sharma, 1998).

Tabela 2. Wyizolowanie (w dniach 0-7) oocyst Cryptosporidium parvum z odchodów cieląt, którym podano oocysty, leczonych lub nieleczonych Nekka-Rich.

Cielęta z dodatnim wynikiem C.parvum2 / całkowita liczba cieląt
Grupa1 0 1 2 3 4 5 6 7
A 0/3
(0,0)
0/3
(0,0)
0/3
(0,0)
0/3
(0,0)
3/3
(1,0)
3/3
(2,0)
3/3
(2,0)
3/3
(2,0)
B 0/3
(0,0)
0/3
(0,0)
0/3
(0,0)
0/3
(0,0)
3/3*
(1,0)
0/3*
(0,0)
0/3*
(0,0)
0/3*
(0,0)

1 A=cielęta z grupy kontrolnej nieleczonej; B= cielęta leczone Nekka-Rich.
2 Dane w nawiasach odnoszą się do liczby oocyst: 0: brak oocyst we wszystkich polach widzenia; 1: <10 oocyst w 30 polach widzenia; 2:≥10 do <300 oocyst w 30 polach widzenia; 3: ≥300 oocyst w 30 polach widzenia.
*P= 0.05 w porównaniu do grupy A (test dokładny Fishera).

 

Zdolność adsorpcyjna węgla aktywowanego zależy od rozmiaru jego porów. Usunięcie materiałów o większych rozmiarach wymaga większych porów, podczas gdy mniejsze substancje wymagają porów o mniejszych rozmiarach (Chandy i Sharma, 1998). W niniejszym badaniu oocysty C.parvum zostały poddane skutecznej adsorpcji przez węgiel aktywowany uzyskany z kory dębu wiecznie zielonego, co sugeruje że ten właśnie węgiel aktywowany posiada pory o średnicy wystarczającej dla oocyst C.parvum. Potwierdzono (dane nieopublikowane), że w węglu aktywowanym pochodzącym z dębu wiecznie zielonego występują pory o zróżnicowanej średnicy, 10μm lub mniejszej. Niedawno odnotowaliśmy, że węgiel aktywowany z dębu wiecznie zielonego ma niską zdolność wiązania do Enterococcus faecium, który jest mniejszy od C. C.parvum (Watarai i Tana, 2005). Sugeruje to, że doustne podanie tego węgla może zredukować liczbę oocyst C.parvum przy jednoczesnej minimalizacji usunięcia normalnej flory bakteryjnej w przewodzie pokarmowym.
Zauważyliśmy także, że ilość oocyst C.parvum uległa zmniejszeniu dzięki podaniu octu drzewnego. Sugeruje to, że ocet drzewny z dębu wiecznie zielonego zawiera składniki o działaniu dezynfekującym wobec oocystC.parvum. Ocet drzewny zawiera kwasy organiczne, które, jak wykazali inni, hamują wzrost mikroorganizmów enteropatogennych (Anderson, 1992; Hsiao i Siebert, 1999; Nakai i Siebert, 2003) i ograniczają zdolność do przeżycia C.parvum (Kniel, 2003). Uważamy zatem, że to kwasy organiczne są odpowiedzialne za działanie hamujące wobec C.parvum.
Nasze wyniki pokazały znaczące działanie terapeutyczne preparatu mlekozastępczego z Nekka-Rich u cieląt zakażonych kontrolnie C.parvum. Podawanie preparatu mlekozastępczego z Nekka-Rich obniżyło intensywność i okres trwania biegunki wywołanej zakażeniem C.parvum. Dodatkowo Nekka-Rich obniżyła ilość oocystC.parvum wyizolowanych z próbek kału. W rzeczywistości w dwa dni po rozpoczęciu podawania Nekka-Rich w pokarmie, nie wyizolowano żadnych oocyst. Co więcej komórki nabłonkowe jelit pochodzących od cieląt karmionych Nekka-Rich nie wykazały przylegania oocyst C.parvum do ich powierzchni, podczas gdy te same komórki pochodzące z jelit cieląt nie karmionych Nekka-Rich wykazały silne przyleganie C.parvum. Wyniki te wskazują, że kolonizacja C.parvum w jelitach cieląt  zainfekowanych C.parvum może zostać całkowicie wyeliminowana poprzez podawanie Nekka-Rich oraz że cielęta zakażone C.parvum mogą zostać wyleczone poprzez podanie im Nekka-Rich.
W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że Nekka-Rich wykazuje działanie ochronne wobec cieląt zainfekowanychC.parvum. Wcześnie zaś udowodniono, że probiotyki (mikroorganizmy, które mają działanie pozytywne dla gospodarza poprzez poprawę równowagi mikrobiologicznej), takie jak bakterie Bifidophilus i bakterie kwasu mlecznego są pożyteczne w leczeniu i zapobieganiu różnych infekcji jelitowych i biegunki wywołanej przez bakterie patogenne (Gorbach, 1990; Abe i in., 1995; Bernet-Camard i in., 1997; Bomba i in., 1999; Naidu i in., 1999; Heyman, 2000; Vold i in., 2000) i C.parvum (Alak i in., 1997, 1999). Nasze wcześniejsze badania wykazały, że ocet drzewny z kory dębu wiecznie zielonego, obecny w Nekka-Rich ma działanie stymulujące wzrost E.faecium i Bifidoacterium thermophilum, które działają jak probiotyki (Watarai i Tana, 2005). Zatem działanie stymulujące octu drzewnego pochodzącego z kory dębu wiecznie zielonego wobec probiotyków może także mieć związek z działaniem niszczącym wobec C.parvum u zakażonych cieląt.

Rycina 3. Obraz z mikroskopu elektronowego reprezentatywnych części jelita biodrowego: A) kosmki jelita biodrowego cielęcia nieleczonego z przylegającymi oocystami C.parvum (strzałka); B) kosmki jelita biodrowego cielęcia, któremu podano Nekka-Rich pokazujące brak przylegających oocyst C.parvum.  Skala barowa 10 μm

c

 

W praktyce nowa metoda hamująca zakażenie oocystami C.parvum może mieć bardzo dużą wartość. Odkryliśmy, że kolonizacja powierzchni błon śluzowych przez C.parvum i wydalanie oocyst z kałem jest skutecznie hamowane przez podawanie Nekka-Rich. Można to wyjaśnić faktem, że węgiel aktywowany z Nekka-Rich wykazał skuteczne działanie w usuwaniu oocyst C.parvum oraz, że ocet drzewny z kory dębu wiecznie zielonego ma działanie dezynfekujące wobec oocyst C.parvum. Wykorzystanie Nekka-Rich jako dodatku mogłoby posłużyć do skutecznego zapobiegania infekcji C.parvum u cieląt, a co za tym idzie ułatwiałoby usunięcie choroby. Dodatkowo zahamowanie wydalania oocyst poprzez podawanie Nekka-Rich znacząco wpłynęłoby na kontrolę zakażenia środowiska i potencjalnego rozprzestrzenienia się choroby poprzez wodę.

WNIOSKI
Oocysty Cryptosporidium parvum uległy adsorpcji w sposób zależny od dawki przez węgiel aktywowany pochodzący z Nekka-Rich. Dodatkowo ocet drzewny zawarty w Nekka-Rich wykazał działanie wobec oocystC.parvum. Wykazano, że Nekka-Rich zwalcza kryptosporydiozę u cieląt. U cieląt nieleczonych z grupy kontrolnej, które zostały zakażone kontrolnie oocystami C.parvum,  wystąpiła biegunka i wydalanie oocyst z odchodami, natomiast u cieląt karmionych preparatem mlekozastępczym zawierającym Nekka-Rich, nastąpiła poprawa w 1. dniu po rozpoczęciu leczenia, zaś w 2. dniu od rozpoczęcia terapii Nekka-Rich nie nastąpiło wydalanie oocyst. W związku z tym dysponujemy bardzo obiecującymi wstępnymi danymi, potwierdzającymi działanie Nekka-Rich przeciw kryptosporydiozie pozwalające na ograniczenie lub wyeliminowanie infekcjiC.parvum u cieląt.