The Final Report 30 November 2012 roku, The Protocol of the study (attachment A) contract between OR SELL Srl and the University of Padua, Dep. MAPS

Badanie przeprowadzono od maja do października 2012 roku, w celu zapewnienia dowodów naukowych o jakości zestawu CANINE HEARTWORM AG 2.0 (CHW AG 2.0), przy użyciu próbek krwi pobranych od populacji psów żyjących zarówno na terenach Dirofilaria immitis endemicznych jak i wolnych północno-wschodniej części Włoch (patrz Protokół badania – załącznik A).

Pobieranie próbek i czynności diagnostyczne

Pobieranie próbek krwi i działania diagnostyczne (tab. 1) przeprowadzono od maja do października 2012 roku od psów o różnej historii epidemiologicznej:

Grupa G1: psy urodzone i zawsze żyjące na terenie wolnym od D. immitis, negatywne dla poprzednich ocen do wykrywania krążących D. immitis mikrofilarii (MFE) i antygenów (AGS);
– Grupa G2: mikrofilaremiczne psy, 2-5 lat, żyjące na terenach D. immitis endemicznych, nigdy nie stosowano leków mikro- i / lub makro-filaricidalnych.
– Grupa G3: psy starsze niż 2 lata,  losowo wybrane spośród osobników żyjących na terenach D. immitis endemicznych.

Dużo wysiłku włożono, by znaleźć psy z terenów endemicznych, które spełniłyby warunki kwalifikujące je do grupy G2. Spośród 17 próbek (tab. 1), 11 zostało zachowanych (zamrożone) w postaci pełnej krwi (n. = 4) lub surowicy (n. = 7) pobrane od wcześniej wykrytych mikrofilaremicznych psów żyjących na terenach endemicznych (dzięki uprzejmości Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro, Padwa, Włochy). Tak więc, nie było możliwe wykonanie testu Knotta na tych próbkach, podczas gdy analizę PCR przeprowadzono na 4 próbkach pełnej krwi.

Tabela 1. Pobieranie próbek krwi i czynności diagnostyczne wykonywane w badaniu

Działania

Wykonywane (n.)

Planowane (n.) w protokole badania

Pobieranie próbek krwi
Grupa G1
Grupa G2
Grupa G3
Całkowita liczba próbek

33
17
90
140

30
30
40
100

Zmodyfikowany test Knotta

118

100

Analiza biomolekularna

120

100

Serologiczne przy użyciu CHW AG 2.0

138

100

Serologiczne przy użyciu SNAP PF

140

100

Serologiczne przy użyciu WITNESS

138

100

Analiza danych

1.1. Obliczanie zgodności
Zgodność pomiędzy różnymi testami została oceniona przez porównanie parami używając wartości statystycznej k oraz wybierając 95% przedział ufności (CI). Wartości k były interpretowane w następujący sposób (Altman DG, 1991. Practical statistics for medical research, London, Chapman and Hall):

Wartość k

Wartość zgodności

<0,200
0,210 – 0,400
0,410 – 0,600
0,610 – 0,800
0,810 – 1,000

Zły
Dostateczny
Umiarkowany
Dobry
Bardzo dobry

Wartość statystyczna k została zastosowana w celu porównania zgodności między:

Testy serologiczne:
– CHW AG 2.0 vs. SNAP HTWM
– CHW AG 2.0 vs.WITNESS
– SNAP HTWM vs.WITNESS

Testy serologiczne i zmodyfikowany test Knotta:
– CHW AG 2.0 vs. zmodyfikowany test Knotta
– SNAP HTWM vs. zmodyfikowany test Knotta
– WITNESS vs. zmodyfikowany test Knotta

Testy serologiczne i analizy PCR:
– CHW AG 2.0 vs. analiza PCR
– SNAP HTWM vs. analiza PCR
– WITNESS vs. analiza PCR

Analiza PCR vs. zmodyfikowany test Knotta

Użytym oprogramowaniem dla Windows było SPSS, wersja 16.0.

1.2. Obliczanie wyników testu
Wyniki każdego testu zostały wyrażone przez obliczenie dokładności (AC), czułości (SE), swoistości (SP), dodatnich (PPV) i negatywnych wartości predykcyjnych (NPV).
Używanym oprogramowaniem było Win EPISCOPE 2.0, przy 95% przedziale ufności.

1.2.1. Wyniki testów serologicznych
Wskaźniki wydajności (AC, SE, SP, PPV, NPV) obliczono dla każdego testu serologicznego, w odniesieniu do poziomu zgodności między wynikami testu i „prawdziwego” stanu klinicznego zwierząt, biorąc pod uwagę zestaw danych (n = 50), w tym grupy G1 (33 niezakażone psy = prawdziwie negatywne) i G2 (17 zakażonych psów = prawdziwie pozytywne).

1.2.2. Wyniki zmodyfikowanego testu Knotta
Wskaźniki wydajności (AC, SE, SP, PPV, NPV) obliczono dla zmodyfikowanego testu Knotta, odnosząc poziom jego zgodności porozumienia z dwoma różnymi zestawami danych:
– Zestaw danych (n = 39), w tym próbek krwi pobranych od zwierząt należących do grupy G1 (33 niezakażone psy = prawdziwie negatywne) i G2 (17 zakażonych psów = prawdziwie pozytywne). Jedenaście próbek zostało wyłączone z grupy G2, ponieważ `były bezużyteczne w wykonywaniu testu Knotta.
– Zestaw danych (n = 116), w tym próbek krwi analizowanych przez zmodyfikowany test Knotta i PCR, biorąc ten ostatni jako złoty standard w wykrywaniu krążących MFE.

1.2.3. Analiza PCR
Próbki poddano ekstrakcji DNA za pomocą NucleoSpin ® Tissue (Macherey-Nagel, Niemcy), podczas amplifikacji PCR z 5S ribosomal spacer  był przeprowadzony z primerami S2-S16. Produkty PCR zostały oczyszczone przy użyciu zestawu High Pure PCR Product Purification (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy)  i sekwencjonowano z obu nici w BMRGenomics Padwa.
Reakcje sekwencjonowania były analizowane i porównywane z tymi w GenBank using BLAST.

Wyniki

1.3. Zgodność pomiędzy testami serologicznymi

1.3.1. CHW AG 2.0 vs. SNAP HTWM

CHW AG 2.0

Razem

Neg.

Poz.

SNAP HTWM

Neg.

109
100%

0
0%

109
100%

Poz.

1
3,4%

28
96,6%

29
100%

Razem

110
79,7%

28
20,3%

138
100%

k = 0,978 – odpowiada bardzo dobrej zgodności

1.3.2. CHW AG 2.0 vs. WITNESS

CHW AG 2.0

Razem

Neg.

Poz.

WITNESS

Neg.

110
94,0%

7
6,0%

117
100%

Poz.

0
0%

21
100%

21
100%

Razem

110
79,7%

28
20,3%

138
100%

k = 0,827 – odpowiada bardzo dobrej zgodności

1.3.3. SNAP HTWM vs. WITNESS

WITNESS

Razem

Neg.

Poz.

SNAP HTWM

Neg.

109
100%

0
0%

109
100%

Poz.

8
27,6%

21
72,4%

29
100%

Razem

117
84,8%

21
15,2%

138
100%

k = 0,806 – odpowiada dobrej zgodności

1.4. Zgodność między testami  serologicznymi oraz mikrofilaremicznym /amikrofilaremicznym statusem psa wykrytym przez zmodyfikowany test Knotta

1.4.1. CHW AG 2.0 vs. zmodyfikowany test Knotta

CHW AG 2.0

Razem

Neg.

Poz.

KNOTT

Neg.

102
95,3%

5
4,7%

107
100%

Poz.

1
11,1%

8
88,9%

9
100%

Razem

103
88,8%

13
11,2%

116
100%

k = 0,700 – odpowiada dobrej zgodności

1.4.2. SNAP HTWM vs. zmodyfikowany test Knotta

SNAP HTWM

Razem

Neg.

Poz.

KNOTT

Neg.

104
95,4%

5
4,6%

109
100%

Poz.

0
0%

9
100%

9
100%

Razem

104
88,1%

14
11,9%

118
100%

k = 0,760 – odpowiada dobrej zgodności

1.4.3. WITNESS vs. zmodyfikowany test Knotta

WITNESS

Razem

Neg.

Poz.

KNOTT

Neg.

104
97,2%

3
2,8%

107
100%

Poz.

5
55,6%

4
44,4%

9
100%

Razem

109
94,0%

7
6,0%

116
100%

k = 0,464 – odpowiada umiarkowanej zgodności

1.5. Zgodność między testami  serologicznymi oraz mikrofilaremicznym /amikrofilaremicznym statusem psa wykrytym w analizie PCR

1.5.1. CHW AG 2.0 vs. analiza PCR

CHW AG 2.0

Razem

Neg.

Poz.

PCR

Neg.

98
94,2%

6
5,8%

104
100%

Poz.

3
21,4%

11
78,6%

14
100%

Razem

101
85,6%

17
14,4%

118
100%

k = 0,666 – odpowiada dobrej zgodności

1.5.2. SNAP HTWM vs. analiza PCR

SNAP HTWM

Razem

Neg.

Poz.

PCR

Neg.

100
94,3%

6
5,7%

106
100%

Poz.

2
14,3%

12
85,7%

14
100%

Razem

102
85,0%

18
15,0%

120
100%

k = 0,712 – odpowiada dobrej zgodności

1.5.3. WITNESS vs. analiza PCR

WITNESS

Razem

Neg.

Poz.

PCR

Neg.

101
97,1%

3
2,9%

104
100%

Poz.

7
50,0%

7
50,0%

14
100%

Razem

108
91,5%

10
8,5%

118
100%

k = 0,538 – odpowiada umiarkowanej zgodności

1.6. Zgodność między mikrofilaremicznym /amikrofilaremicznym statusem psa wykrytymi przez zmodyfikowany test Knotta oraz w analizie PCR

PCR

Razem

Neg.

Poz.

KNOTT

Neg.

104
97,2%

3
2,8%

107
100%

Poz.

0
0%

9
100%

9
100%

Razem

104
89,7%

12
10,3%

116
100%

k = 0,843 – odpowiada bardzo dobrej zgodności

1.7. Wyniki testów serologicznych

1.7.1. CHW AG 2.0

CHW AG 2.0

Razem

Neg.

Poz.

ZAKAŻONY

Nie

33
100%

0
0%

33
100%

Tak

0
0%

17
100%

17
100%

Razem

33
66,0%

17
34,0%

50
100%

AC, SE, SP, PPV, NPV = 100%

1.7.2.  SNAP HTWM

SNAP HTWM

Razem

Neg.

Poz.

ZAKAŻONY

Nie

33
100%

0
0%

33
100%

Tak

0
0%

17
100%

17
100%

Razem

33
66,0%

17
34,0%

50
100%

AC, SE, SP, PPV, NPV = 100%

1.7.3. WITNESS

WITNESS

Razem

Neg.

Poz.

ZAKAŻONY

Nie

33
100%

0
0%

33
100%

Tak

4
23,5%

13
76,5%

17
100%

Razem

37
74,0%

13
26,0%

50
100%

AC = 92,0%, SE = 76,5%, SP = 100%, PPV = 100%, NPV = 89,2%

1.8. Wyniki zmodyfikowanego testu Knotta

1.8.1. Dotyczy zakażonych /niezakażonych zwierząt

KNOTT

Razem

Neg.

Poz.

ZAKAŻONY

Nie

33
100%

0
0%

33
100%

Tak

0
0%

6
100%

6
100%

Razem

33
84,6%

6
15,4%

39
100%

AC, SE, SP, PPV, NPV = 100%

1.8.2. Dotyczy wyników PCR

Biorąc pod uwagę poziom zgodności między zmodyfikowanym testem Knotta i PCR (patrz punkt 3.4), następujące wskaźniki zostały obliczone:

AC = 74,4%, SE = 75,0%, SP = 100%, PPV = 100%, NPV = 97,2%

1.9. Analiza PCR

Łącznie 120 próbek krwi zostało poddanych analizie PCR. Wyniki przedstawiono w tabeli 2, w odniesieniu do różnych grup próbek (G1, G2 i G3).

Tabela 2. Wyniki PCR dla różnych grup próbek

Grupy

Badane (n.)

Pozytywne (n.)

Sekwencjonowanie

G1
G2
G3

32(*)
10(**)
78

0
8
6


Dirofilaria immitis
Dirofilaria immitis

Razem

120

14

(*) jedna próbka nie została przebadana z powodu małej ilości krwi
(**) 4/10 próbek krwi zostały zamrożone (patrz punkt 1)

Nie wykryto PCR – pozytywnych próbek w negatywnej grupie kontrolnej (G1). Obecność DNA D. immitis wykryto w 8/10 próbek należących do pozytywnej grupy kontrolnej (G2;  numery akcesyjne: EU 360961.1, EU 360965.1), tymczasem 2 zamrożone próbki krwi dały wynik negatywny w analizie PCR. Spośród 78 próbek grupy G3 6 było pozytywnych dla D. immitis (numery akcesyjne: EU 360964.1, EU 360965.1).

Komentarze

1.10. Pobieranie próbek
Dużą trudność sprawiło znalezienie próbek krwi od zwierząt pozytywnych (w tym w grupie G2), prawdopodobnie ze względu na duże rozpowszechnianie programów profilaktycznych realizowanych przez właścicieli psów na terenach endemicznych północno-wschodnich Włoch. Z tego powodu w badaniu można było uwzględnić tylko 17 próbek, 6 zostało pobranych bezpośrednio od zwierząt i 11 przekazanych z Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (Legnaro, Padwa, Włochy), z których 4 pełnej krwi i 7 surowic, uzyskano od wcześniej wykrytych mikrofilaremicznych psów żyjących na terenach endemicznych.

1.11. Przedstawienie porównania testów serologicznych
Bardzo dobre wartości zgodności zostały stwierdzone między CHW AG 2.0 a najczęściej używanymi zestawami handlowymi SNAP HTWM (k = 0,978) i WITNESS (k = 0,827) (patrz punkt 3.1).
Tylko jedna próbka krwi (w grupie G3) dała wynik ujemny w immunochromatograficznych testach CHW AG 2.0 i WITNESS, natomiast pozytywny w ELISA SNAP HTWM. W próbce tej krążące MFE zostały wykryte przez zmodyfikowany test Knotta i w analizie PCR.
Zarówno w teście CHW AG 2.0 jak i SNAP HTWM stwierdzono 7 próbek pozytywnych, które to dały wynik negatywny w teście WITNESS. Wśród tych próbek, 4 należały do grupy G2 (kontrole pozytywne) a 3 do grupy G3 (losowo pobierane od osobników żyjących na terenach D. immitis endemicznych).
Chociaż bardzo dobra wartość zgodności została zaobserwowana między testami  serologicznymi w porównaniu parami wykonywane przez wartość statystyczną k, godne jest uwagi to, że zarówno CHW AG 2.0 jak i SNAP HTWM pokazał wszystkie przedstawione wartości indeksu (AC, SE, SP, PPV, NPV) odpowiadające 100%, podczas gdy niższe wartości SE (76,5%; Cl = 56,3-96,6) oraz NPV (89,2%; Cl = 79,2-99,2) zostały wykryte w teście WITNESS (patrz rozdział 3.5). Porównując do tego ostatniego, CHW AG 2.0 wydaje się być immunochromatograficznym testem wykazującym lepsze osiągnięcia do szybkiego wykrywania zakażeń HW w praktyce klinicznej, zmniejszając diagnostyczne ryzyko wystąpienia fałszywie ujemnych próbek.

1.12. Wykrywanie utajonych infekcji nicienia (HW)
Do badania wybrano łącznie 116 próbek krwi, które były analizowane przy użyciu testu Knotta oraz wszystkie testy serologiczne. Spośród tych próbek 9 (7,8%) było dodatnich w zmodyfikowanym teście Knotta, 14 (12,1%) w SNAP HTWM, 13 (11,2%) w CHW AG 2.0 i tylko 7 (6,0%) w WITNESS, co potwierdza, że ostatni test jest o niższej czułości.
W sumie 5/107 (4,7%) wykrytych przypadków utajonych zakażeń HW (t.j. dodatni wynik w co najmniej jednym z testów serologicznych i negatywny w teście Knotta) stwierdzono, że należą one do psów z grupy G3.
Wszystkie te przypadki zostały wykryte zarówno przez test CHW AG 2.0 jak i SNAP HTWM, natomiast zestaw  WITNESS pozwolił wykryć 3/107 (2,8%).

1.13. Zgodność między testami serologicznymi i wykrywaniem mikrofilarii
Przeprowadzone analizy wartości statystycznej k, zarówno dla SNAP HTWM i CHW AG 2.0 pokazały dobrą wartość zgodności (0,666 ≤k ≤ 0,760) ze zmodyfikowanym testem Knotta i PCR (patrz punkty 3.2 i 3.3), zaś tylko umiarkowaną wartość zgodności zaobserwowano w porównaniu z parami testów: WITNESS vs. zmodyfikowany test Knotta (k = 0,464) i WITNESS vs. analiza PCR (k = 0,538). Należy podkreślić, że testy serologiczne i wykrywanie MFE reprezentują podejście diagnostyczne zdecydowanie różne w ich „celu” (odpowiednio cele w wykrywaniu antygenów i zarodków D. immitis). Więc, rozbieżności między tymi diagnostycznymi metodami są oczekiwane i mogą być spowodowane: (a) możliwość utajonych zakażeń HW (patrz punkt 4.3) i / lub (b) bardzo niski poziom krążących antygenów (AGS) jako konsekwencji śmierci dorosłych, tymczasem krążące MFE są wciąż obecne w związku z ich zdolnością do przeżycia przez dłuższy czas (do jednego roku lub więcej) niż ASG. W tym badaniu, hipotezy zarówno (a) i (b) muszą być wykluczone dla zwierząt włączonych do grup G1 i G2, zgodnie z warunkami określonymi w protokole (odpowiednio kontrole negatywne i pozytywne; patrz punkt 1). Na tej podstawie, godne jest uwagi to, że wszystkie próbki negatywne były w CHW AG 2.0 i SNAP HTWM, ale pozytywne w zmodyfikowanym teście Knotta (odpowiednio 1 i 0 próbek; patrz punkty 3.2.1 i 3.2.2) oraz PCR (odpowiednio 3 i 2 próbki; patrz punkty 3.3.1 i 3.3.2) należały do grupy G3 (w tym próbki krwi losowo pobrane od psów żyjących na terenach D. immitis endemicznych). Przeciwnie, niezgodności między negatywnymi w WITNESS i wykrywaniem krążących MFE zaobserwowano również w 3 próbkach należących do grupy G2 (kontrole pozytywne). W szczególności krążące mikrofilarie wykryto w 5 (3 w G2 i 2 w G3) oraz 7 (3 w G2 i 4 w G3) WITNESS próbek ujemnych odpowiednio zmodyfikowanym testem Knotta i analizą PCR (patrz punkty 3.2.3 i 3.3.3).

1.14. Zmodyfikowany test Knotta
Do przedstawienia wyników zmodyfikowanego testu Knotta (patrz punkt 3.6) potrzeba bardzo dokładnej oceny.
Wysoka wartość (100%) z indeksów obliczonych wyników dla tego testu spowodowane jest małą liczbą kontroli pozytywnych (prawdziwie pozytywne = 6), które można umieścić w grupie G2 oraz tym, że mikrofilaremiczny stan był wymagany, aby zapisać zwierzęta do tej samej grupy próbek. Z tego powodu oraz w celu uniknięcia wystąpienia nieporozumień w ocenach dotyczących zmodyfikowanego testu Knotta, uznano za właściwe zastosowanie wartości statystycznej k w porównaniu z parami pomiędzy zmodyfikowanym testem Knotta i PCR (patrz punkty 3.4 i 3.6.2), biorąc ten ostatni jako złoty standard (bardziej czuły test) do wykrywania krążących MFE. Choć bardzo dobra wartość zgodności (k = 0,843) została uzyskana w tym porównaniu, zmodyfikowany test Knotta pokazał możliwość uzyskiwania prawidłowej diagnozy (AC = dokładność) w 74,4% przypadków przy czułości (SE = odsetek zakażonych zwierząt wykrytych w teście) 75% (CI = 50,5% -99,5%) i NPV (NPV = prawdopodobieństwo, że zwierzęta badane jako negatywne są naprawdę niezakażone) z 97,2% (94,1% -100%). W innym przypadku zmodyfikowany test Knotta pokaże wartość 100% w SP (swoistość) i PPV (dodatnie wyniki), co odpowiada prawdopodobieństwu, że badane zwierzęta jako pozytywne są naprawdę zakażone.
Ponadto, należy podkreślić, że zmodyfikowany test Knotta, jak każda inna technika diagnostyczna (w tym analiza PCR) ma za cel wykrywanie krążących MFE, może nie w diagnostyce dając fałszywie ujemne wyniki w przypadku utajonych zakażeń HW, również w północno-wschodniej części Włoch ze względu na niewłaściwe stosowanie iwermektyny podczas programów profilaktycznych HW. To świadczy również o przypadkach ukrytych zakażeń HW wykrytych w tym badaniu (patrz punkt 4.3).

Wnioski

  • Wynik CHW AG 2.0 wydaje się być równoważny do tego z SNAP HTWM, test szeroko stosowany we Włoszech przez lekarzy weterynarii.
  • Porównany do immunochromatograficznego testu WITNESS, CHW AG 2.0 ukazuje lepsze osiągnięcia do szybkiego wykrywania zakażeń HW w praktyce klinicznej, zmniejszając diagnostyczne ryzyko fałszywie ujemnych próbek.
  • W porównaniu do SNAP HTWM i WITNESS, CHW AG 2.0 jest szybszy i łatwiejszy w użyciu podczas działań klinicznych (mniej etapów dla lekarza weterynarii).

 

Odpowiedzialny za Laboratorium
Parazytologii i Chorób Pasożytniczych

Prof. Mario Pietrobelli

– RAPORT KOŃCOWY Z 30 LISTOPADA 2012 ROKU –
Protokół badania (załącznik A) umowy pomiędzy
Company OR SELL Srl i the University of Padua, Dep. MAPS